Molecular Carcinogenesis 分子致癌作用
(寬葉獨行草的抗腫瘤活性)
[寬葉獨行草] 的抗腫瘤活性及其主要活性成分1-氰基-2,3-環硫丙烷的鑑定
食用十字花科（Cruciferae）的蕓苔屬（Brassica）蔬菜與降低患癌症的風險有關，但對活性成分的鑑定和對潛在分子的洞察卻很少。在這裡，我們發現寬葉獨行菜（Lepidium latifolium），一種原產於南歐、地中海國家和亞洲的十字花科植物，其萃取在多種人類腫瘤細胞中，表現出體外細胞毒活性（cytotoxic activity），誘導胱天蛋白酶依賴性的細胞凋亡（caspase-dependent apoptosis）。而其植物汁液，在HT-29O人類大腸癌異種移植至老鼠的模型中，表現出體內抗腫瘤活性（antitumor activity）。1-氰基-2,3-環硫丙烷（1-cyano-2,3-epithiopropane 或 CETP）被確定為寬葉獨行菜的主要活性癌細胞殺傷原理。合成和植物來源的 CETP，均顯示出類似的促進細胞凋亡活性（proapoptotic activities），如通過生化和形態學分析所評估的那樣。分析CETP對來自NCI-60 細胞系組的大量癌細胞系的抗增殖能力，然後進行比較分析（compare analysis）。NCI-60 細胞系組，以60個不同類型的人類癌細胞株為對象，進行活體外活性分析，並利用這些細胞株建立腫瘤異種移植動物模。結果顯示出，與已知抗癌劑不同的活性特徵。以流式細胞技術（flow cytometry）在流體狀態下觀測細胞，以及生化分析表明，CETP誘導的細胞凋亡涉及線粒體。這通過線粒體跨膜電位的喪失，以及活性氧的產生來評估，而 BcI-XL和Bcl-2 的超量表達，阻止了CETP誘導的細胞凋亡。穀胱甘肽（glutathione）和 N乙醯半胱氨酸（N-acetyl cysteine）對活性氧的抑制，降低了CETP誘導的細胞凋亡反應。Fas偶聯死亡區域蛋白（Fas-associated death domain protein 或 FADD）顯性負面形式，阻斷 Fas/ CD95 信號。特定的胱天蛋白酶-8 抑製劑，也抑制 CETP 誘導的殺傷。 總之，我們的數據表明，CETP的癌細胞殺傷作用，涉及內在和外在的細胞凋亡信號通路，是寬葉獨行菜抗腫瘤活性的基礎，這可能對癌症治療具有潛在的意義。
關鍵詞
抗腫瘤活性（antitumor activity），十字花科蔬菜（cruciferous vegetables），環硫腈（epithionitrile），體內動物模型（in vivo animal model），寬葉獨行菜（Lepidium latifolium）
縮寫：
△Ψm，線粒體跨膜電位；CETP，1- cyano-2,3-epithiopropane，1-氰基-2,3-環硫丙烷；[DiOC6(3)]，3,3'-dihexyloxacarbocyanine iodide，3,3'-二乙基氧雜羰花青碘; DHE，二氫乙啶；ESP，上皮硫特異蛋白；GSH，穀胱甘肽；ROS，活性氧；SCID，嚴重聯合免疫缺陷。
1 | 介紹
獨行菜（Lepidium）是十字花科（Brassicaceae）植物的一個屬，包括全世界發現的約175 種。 1 獨行菜是一種原產於南歐的植物。地中海國家和亞洲。寬葉獨行菜（Lepidium latifolium L.）的葉子，也有幾個常用名稱，包括perennial pepperweed、broadleaved pepperweed、pepperwort、peppergrass、dittander、dittany和tall whitetop。它已在傳統醫學中，廣泛使用2000多年。在西班牙，這種植物因其對腎結石的作用，而在當地被稱為「碎腎石器（rompepiedras）」。2 寬葉獨行菜是拉達克（印度）寒冷乾旱地區首選的植物食品之一，對喜馬拉雅山地區人士的飲食習慣作出重要貢獻。3,4 此外，這種植物是硫代葡萄糖苷（Glucosinolates）極好來源，尤其是含有大量烯丙基芥子油苷（sinigrin），約佔70-90%。4寬葉獨行菜也被報導具有利尿作用，2,5 並可減少老鼠模型中的前列腺增生。6
飲食和其他環境因素，對個體患腫瘤疾病的風險有深遠的影響。流行病學研究表明，富含水果和蔬菜的飲食具有抗癌作用，人們將注意力集中在具有生物活性的植物次級代謝產物（統稱為植物化學物質），發揮抗癌活性的可能性上。7 越來越多的證據表明，十字花科蔬菜具有抗癌作用，尤其是消化道腫瘤。因此，富含蕓苔屬（Brassica）蔬菜的飲食可以降低患癌症的風險，包括肺癌、胃癌和結直腸癌，可能還包括前列腺癌和卵巢癌。8-11這些植物的抗癌特性，歸因於大量硫代葡萄糖苷的獨特存在。它是一類植物化學物質，由β-D-硫代葡萄糖基團（β-D-thioglucose group）、磺化肟部分（sulfonated oxime moiety）和高度可變的側鏈組成，側鏈來源於氨基酸（amino acids）。12大量證據表明，硫代葡萄糖苷水解產物，是十字花科蔬菜抗癌特性的原因，而不是硫代葡萄糖苷本身。13,14 通過切割或咀嚼，破壞原始十字花科植物，會導致硫代葡萄糖苷水解。例如：烯丙基芥子油苷，是由內源性βD-硫代葡萄糖苷酶芥子酶（EC3.2.1.147）產生不穩定的中間體，可產生各種水解產物。15 這些降解產物，其中許多具有生物活性，包括被取代的有機硫氰酸酯（thiocyanates）、異硫氰酸酯（isothiocyanates）、腈（nitriles）和環硫腈（epithionitriles），它們的形成，取決於所研究的植物種類、上皮硫特異蛋白（ESP）的存在、細胞酸鹼值（pH）和細胞鐵濃度 16,17（圖1）。 此外，與已知ESP具有63-68% 氨基酸序列同一性的硫氰酸酯形成蛋白(thiocyanates forming proteins 或TFP)，也在寬葉獨行菜中被鑑定出來。與ESP類似，它參與環硫腈和硫氰酸酯形成的合成，並且鐵促進了它的作用 18,19（圖1）。
十字花科蔬菜的某些成分，被稱為對某些腫瘤細胞具有促凋亡潛力。20-23
烯丙基芥子油（sinigrin）的酶促降解（Enzymaticdegradation）。內源性芥子酶（Myrosinase）對烯丙基芥子油苷的水解，產生不穩定的中間體，根據細胞酸鹼值（pH）、細胞鐵濃度和上皮硫特異蛋白（ESP）和硫氰酸酯形成蛋白（TFP）的存在。細胞凋亡和壞死是細胞死亡的兩種主要方式。在細胞凋亡過程中，會發生許多典型的形態學變化，包括：貼壁細胞聚集（roundingup）、起泡（blebbing）、細胞皺縮（cell shrinkage）、固縮（pyknosis）和核破裂（karyorrhexis）。而壞死（necrosis），導致細胞腫脹和核溶解。24,25兩個主要的信號通路使細胞凋亡， 即質膜上的外在或死亡受體（death receptor）介導的通路，以及涉及線粒體的內在通路。外在途徑，是由死亡受體與其同源配 體在質膜上的結合而啟動，這導致通過Fas偶聯死亡區域蛋白（Fasassociated death domaincontaining protein或FADD）中存在的死亡結構域之間的同型相互作用，募集FADD和死亡受體。FADD還包含一個死亡效應域，它與半胱天冬酶原-8或-10（procaspase-8 or -10）中的串聯死亡效應域同型相互作用。26 這些相互作用形成了三元死亡誘導信號複合物(DISC)，27導致半胱天冬酶原-8的自催化激活，以及隨後通過半胱天冬酶級聯傳遞信號。半胱氨酸蛋白酶，通過降解幾種細胞成分，在啟動和執行細胞凋亡程序中發揮關鍵作用，導致細胞凋亡表型，其中半胱氨酸蛋白酶-3被認為是最重要的半胱氨酸蛋白酶之一。在其他底物中，半胱氨酸蛋白酶-3將ICAD（CAD抑製劑）切割成游離CAD（半胱氨酸蛋白酶激活的 DNase），從而導致DNA片段化為寡核小體大小的片段。DNA的這種小體間斷裂是細胞凋亡的生化標誌。死亡受體也可以獨立於其配體，通過脂筏膜結構域中的死亡受體聚集參與。28,29 啟動細胞凋亡的內在信號通路，涉及多種非受體介導的刺激，這些刺激會產生細胞內信號，這些信號直接作用於細胞內的靶標，並且是線粒體啟動的事件。30 所有這些刺激都會引起線粒體內膜的變化，從而導致線粒體通透性轉換孔打開、線粒體跨膜電位喪失，以及幾種通常隔離的促凋亡蛋白從膜間隙釋放到胞質溶膠中，從而激活導致凋亡細胞死亡的半胱天冬酶依賴性途徑。Bcl-2蛋白家族控制線粒體膜通透性，並且有促凋亡和抗凋亡成員。這有利於或阻止滲透性轉換孔的打開，以及線粒體中凋亡蛋白的釋放。 30在這裡，我們分析了寬葉獨行菜的體外和體內抗腫瘤特性，並將CETP鑑定為，促進多種腫瘤細胞凋亡的最活躍成分。
2 ｜材料和方法
2.1 化學品
半胱天冬酶原抑製劑（Pan-caspase inhibitor）z-VAD-fmk和胱天蛋白酶-8 抑製劑（caspase-8 inhibitor）z-IETD-fmk購自Calbiochem (比爾里卡, MA)。XTT細胞增殖試劑盒，購自Roche Molecula rBiochemicals（瑞士，巴塞爾）。3,3'-二乙基氧雜羰花青碘（3, 3'-dihexyloxacarbocyanineiodide），購自Molecular Probes（尤金, OR）。化學發光檢測試劑盒，購自Amersham Biosciences（小查爾方特，白金漢郡，英國）。Immobilon-P膜，購自Millipore(Temecula,CA)。除非另有說明，否則所有其他化學品和試劑均來自Sigma- Aldrich（聖路易斯，密蘇里州）。
2.2 植物材料及寬葉獨行菜汁的製備本研究中使用的寬葉獨行菜植物標本，於2006年5月在 Penafiel（西班牙巴利亞多利德）採集。樣本存放在薩拉曼卡大學植物標本館（參考編號：SALA 37251）。植物材料由EnriqueRico博士（西班牙薩拉曼卡大學植物學系）鑑定。寬葉獨行菜的葉子用水洗滌，在液氮下冷凍，在A10基礎研磨機（IKA® Werke GmbH & Co. KG，Staufen，Germany）中研磨，並保存在-80°C。然後通過在水浴中加熱解凍冷凍產品，隨後以2500g離心。收集上清液（supernatant），加入0.1m MFeSO4(7H2O)和抗壞血酸（ascorbic acid）。並用0.1M HCl，將pH調節至4.0。將該混合物在35°C下，加熱4小時，以促進自溶，將最終產品等分，並儲存在80°C下直至使用。如補充方法中所示，通過氣相層析法（gas chromatography），測定果汁中CETP的產量(1500 ppm)。
2.3 寬葉獨行菜主要細胞毒活性成分的提取、分離與鑑定有關寬葉獨行菜物主要活性成分的提取、分離和鑑定的詳細信息包含在補充方法中。
2.4 (±)2-(硫環丙烷-2-基)乙腈（(±)2- (thiiran-2-yl) acetonitrile）[1-氰基-2,3-環硫丙烷（1-cyano-2,3- epithiopropane 或 CETP）] 的合成有關 CETP 合成的詳細信息，包含在補充方法中。
2.5 細胞培養
來自美國典型培養物保藏中心（馬里蘭州羅克維爾）、歐洲細胞培養物保藏中心（ECACC，英國）和德國微生物和細胞培養物保藏中心（Deutsche Sammlungvn Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH-DSMZ）被使用。細胞在含有10% (v/v) 熱滅活胎牛血清(FBS)(Invitrogen)、2mM L-谷氨酰胺（L- glutamine）、100U/Ml青黴素（penicillin）和100 μg/mL鏈黴素（streptomycin）的RPMI-1640或 DMEM培養基中培養，於37°C含5% CO2的潮濕空氣中。由M.L. Schmitz（Justus-Liebig-university, Giessen, Germany）提供JurkatFADD-DN 細胞系，是一種用編碼FADD蛋白(FADD-DN)顯性失活形式的 pcDNA3 表達載體穩定轉染的Jurkat衍生克隆。這種Jurkat-FADD-DN細胞系組成型表達FADD- DN，從而阻斷Fas/CD95死亡受體下游信號轉導，31並維持在含有200μg/mL G418 (Sigma) 的完全培養基中。根據製造商的說明，還使用Lipofectamine2000（Invitrogen / Life Technologies，Carlsbad，CA），以對照pcDNA3空載體轉染Jurkat細胞。
2.6 細胞轉染（Cell transfection）通過電穿孔（HEL cells）或使用 Lipofectin 試劑（Life Technologies）（HeLa細胞）轉染細胞，SFFV-Neo 表達載體，包含人類bcl-2 或人類 bcl-xL開放閱讀框，由長末端重複驅動脾病灶形成病毒（pSFFV-bcl-x L或 pSFFV-bcl-2）。32-34通過在 1 mg/mL (HEL) 或 600μg/mL (HeLa) G418（Sigma）存在下生長選擇轉染的克隆，然後在250 ug/mL的G418下培養，通過蛋白質轉漬法（Western blotting），使用抗bcl-2 和抗bcl-x L抗體，檢測轉染的基因的表達。32-34用空SFFV-Neo質粒，進行細胞轉染作為對照。
2.7 細胞生長抑制試驗
根據製造商的說明，通過使用XTT（鈉3’-[1-(苯基氨基羰基)-3,4-四唑鎓]-雙(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸水合物）（sodium 3'.11-(phenylaminocarbonyl)-3,4tetrazolium]-bis(4-methoxy-6-nitro) benzene sulfonic acid hydrate）細胞增殖試劑盒（Roche Molecular Biochemicals)，抑制細胞的增殖。細胞在含有10% 熱滅活FBS的RPMI-1640或DMEM培養基中孵育，在不存在和存在濃度範圍為10^-3至10^-9 M的CETP的情況下，於96孔平底微量滴定板中，並在 37°C 的潮濕空氣/二氧化碳 (19/1) 環境中，孵育72小時後，進行XTT測定。使用微量滴定板讀數器（Infinite F500 Tecan板讀數器，英國）在490 nm 的測試波長和655 nm 的參考波長下，測量生成的甲臢（formazan）產物的吸光度。每個測定接種的細胞數量，取決於細胞類型及其生長速率（在 100 µL 中介於 1.5-6.0 x 10^3 之間）。測量一式三份地進行，每個實驗重複三次。Gl50值，定義為達到50%生長抑制所需的藥物濃度，在每個細胞系中測定。
2.8 GI50均值圖及比較分析
如網站 http://www.dtp.nci.nih.gov/docs/compare/compare.html 中所述進行GI50平均圖和比較分析。通過繪製從上述 GI50 值組生成的正值和負值來創建平均圖。正值和負值沿垂直線繪製，垂直線表示，面板中所有細胞係對測試劑的平均響應。正值投射到垂直線的右側，表示細胞對超過平均值的測試劑的敏感性。負值向左投射，表示細胞係對測試劑的敏感性低於平均值。正值和負值（稱為增量）是通過三步計算從 GI50 數據中生成的。針對測試化合物測試的每個細胞系的GI50 值被轉換為其 log10 GI50 值。這些log10 GI50值是平均的。從平均值中減去每個 log10 Gl50 值以創建增量。因此，向右突出兩個單位的條，表示該細胞系的GI50出現時的測試劑濃度，比實驗中使用的所有細胞系所需的平均藥物濃度，低100倍。
2.9 細胞凋亡（Apoptosis）試驗
凋亡細胞的定量，通過流式細胞術（flow cytometry），確定為細胞週期分析中sub-G0/G1區域（亞二倍體）中的細胞百分比。36 4-5 x 10^5個細胞用於這些流式細胞術檢測。此外，通過分離片段化的DNA，隨後在1%(w/v)瓊脂糖凝膠（agarose gels）上進行電泳（electrophoresis），並如前所述用溴化乙錠（ethidium bromide）染色，進一步評估細胞凋亡。32,37通過將細胞，與結合到異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate 或FITC）和碘化丙啶（propidium iodide）（膜聯蛋白（Annexin）V-FITC 凋亡檢測試劑盒，西格瑪奧德里奇公司）的膜聯蛋白V，一起孵育細胞來分析人類HeLa癌細胞中細胞死亡的誘導。通過 膜聯蛋白V-FITC結合（磷脂醯絲胺酸（phosphatidylserine）外部暴露導致的細胞凋亡測量）和碘化丙啶（propidium iodide）染色，即細胞凋亡後壞死或繼發性壞死的測量，以監測細胞死亡的誘導。
2.10 線粒體跨膜電位（△Ψm）和活性氧（ROS）產生的細胞熒光分析（Cytofluorimetric analysis）為了評估線粒體跨膜電位（△Ψm）和活性氧 (ROS) 的產生，細胞在含有2 0 μM 3,3'-二乙基氧雜羰花青碘（3,3'-dihexyloxacarbocyanine iodide 或 [DiOC6(3)]）（綠色熒光）（Molecular Probes）的 PBS 中孵育，和2 µm二氫乙啶(DHE)（氧化後紅色熒光）(Sigma) 在37°C下40分鐘，然後在Becton Dickinson（富蘭克林湖，新澤西州）熒光激活細胞分選(FACS)Calibur 流式細胞儀中進行分析。36
2.11 蛋白質轉漬法（Western blot analysis）通過離心沉澱約3-5 x 10^6 個細胞，用PBS洗滌，裂解，並進行蛋白質轉漬法（Western blot analysis）。36 蛋白質（30-40µg）在還原條件下，通過 SDS 聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide gels）分離，轉移到 Immobilon-P 膜（Millipore，Bedford，MA），用5% 脫脂奶粉封閉，並與相應的抗體孵育過夜。使用增強型化學發光檢測試劑盒（Amersham Biosciences，Aylesbury，UK）開發信號。使用小鼠單克隆抗β-肌動蛋白抗體 AC15 (Sigma) 進行免疫印跡作為內部上樣對照，顯示凝膠的每個泳道中的蛋白質含量相等。本研究中使用的抗體如下：抗 20 kDa 活性胱天蛋白酶-8（1:500稀釋）山羊多克隆抗體（Sta. Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）； 抗55-58 kDa 半胱天冬酶原-8 (Ab-3)（1:500 稀釋）單克隆抗體（Oncogene Research Products. Cambridge, MA），也可檢測18-20 kDa 活性形式的胱天蛋白酶-8；AC-15抗42 kDa F-肌動蛋白（1:5000 稀釋）小鼠單克隆抗體（Sigma）；抗17和19kDa 裂開的-胱天蛋白酶-3（1:1000 稀釋）兔單克隆抗體（Cell Signaling，Danvers，MA）；C2.10抗116 kDa聚（ADP-核糖）聚合酶 (PARP)（1:1000 稀釋）小鼠單克隆抗體，也可檢測p85 切割片段（BD Biosciences Pharmingen，San Diego，CA）；抗25-29 kDa BCI-X（1:500 稀釋）兔多克隆抗體（BDBiosciences Pharmingen）； 抗 24-27 kDa Bcl-2（1:1000 稀釋）兔多克隆抗體（Transduction Laboratories, Lexington, KY）。
2.12 異種移植小鼠模型
本研究中的動物程序符合西班牙 (Real Decreto RD1201/05)和歐盟 (European Directive 2010/63/EU) 關於保護和人道使用實驗室動物的動物實驗指南，土地在薩拉曼卡大學認可的動物實驗設施 (Servicio de Experimentacion Animal)。程序經薩拉曼卡大學倫理委員會批准。雌性 CB17-嚴重聯合免疫缺陷(SCID)小鼠（8 週齡）（查爾斯河實驗室，里昂，法國），根據機構指南保存和處理，符合西班牙立法，在12/12小時 光照/黑暗循環下，溫度為22°C，接受標準飲食和酸化水。在CB17-SCID 小鼠的右脅腹皮下，接種 5 x 10^6 HT-29 細胞。這些細胞在 100 µL PBS 和 100 µL Matrigel 基底膜基質（Becton Dickinson）中。 當腫瘤明顯時，小鼠被隨機分配到一組，每組七隻，每天口服 200 µL寬葉獨行菜汁液（12 mg CETP/kg 體重）或等體積的水（對照）。每隔5天，用卡尺測量腫瘤的最短和最長直徑，並使用以下標準公式計算腫瘤體積（mm ^ 3）：（最短直徑）^2 x（最長直徑）x 0.5。監測動物體重和任何發病跡象。在這項研究中，在整個體內試驗中，沒有檢測到藥物治療小鼠的體重減輕和明顯毒性。藥物處理持續25天，最後一次給藥後24小時處死小鼠。然後，腫瘤異種移植物被摘除、測量和稱重，並進行了涉及腫瘤和不同器官的屍檢分析。
2.13 統計分析
給出的結果，是所示實驗次數的平均值 (±SE)。通過司徒頓t檢定（Student's t-test）進行統計評估。P值<0.05 被認為具有統計學意義。
3 | 結果
3.1 寬葉獨行菜萃取顯示出體外抗腫瘤活性製備了六種不同的寬葉獨行菜萃取：乙醇（ethanol）、氯仿（chloroform）、超臨界流體（supercritic fluids）、水、蛋白質和甘油（glycerol）。去除溶劑後，將萃取準確稱量，溶解在二甲基亞碸（dimethyl sulfoxide，DMSO）中，並測定細胞凋亡活性對抗癌細胞。在不同的萃取中，氯仿萃取顯示出最高的細胞凋亡活性（補充表 S1）。在更廣泛的分析中，氯仿萃取在孵育24和48小時後，在大量人類癌細胞中誘導凋亡。隨著孵育時間的延長，凋亡細胞的百分比增加（65.7%、 98.6%、27.4% 和 64.4%）。在孵育 48小時後，分別在人類前列腺癌 PC-3 細胞、宮頸上皮癌 HeLa 細胞、結腸癌HT-29 細胞和肺癌A549 細胞中發生細胞凋亡（補充表 S2）。 將許多不同的實體瘤來源和血液學人類癌細胞系，與不同濃度的寬葉獨行菜氯仿萃取孵育，導致以劑量依賴性方式誘導細胞凋亡（補充表 S2 和圖 2A）。如所評估的，通過流式細胞術在細胞週期分析中出現 sub-G0 /G1 群體（亞二倍體（hypodiploidy））。
寬葉獨行菜萃取誘導細胞凋亡。(A)在不存在（對照）或存在寬葉獨行菜氯仿萃取（1 mg/mL）的情況下，將指定的人類癌細胞系孵育48小時，然後通過流式細胞術分析細胞週期。這顯示了代表凋亡細胞的 sub-G0 /G1區域中的細胞百分比。 (B) PC-3 細胞與 1 mg/mL 寬葉獨行菜氯仿萃取一起孵育指定的時間，並按照第2節中所述提取和分析片段化的DNA，泳道 1，123-bp DNA 階梯用作標準品（ STD）；泳道 2，未處理的對照細胞；泳道3和4，細胞用寬葉獨行菜萃取處理24和48小時。(C) PC-3 細胞用1 mg/mL 寬葉獨行菜氯仿萃取處理指定時間。然後使用指定蛋白質的特異性抗體，通過蛋白質轉漬法（Western blot）進行分析。顯示了全長PARP切割產物p85以及半胱天冬酶原-8及其18-20 kDa切割形式的遷移位置。β肌動蛋白（β-Actin）用作每個道中等量蛋白質加載的內部對照。顯示的數據是，三個獨立實驗的平均值±SE（A）或代表性（B，C）
此外，過表達（overexpress）抗凋亡致癌基因 bcr-abl 的慢性粒細胞白血病K562細胞，也對該植物萃取敏感（補充表 S2 和圖2A）。寬葉獨行菜萃取還在人類紅白血病HEL細胞中，誘導有效的細胞凋亡反應（補充表S2和圖2A）。但通過基因轉移 bcl-XL或bcl-2 的過表達，抑制了寬葉獨行菜的氯仿萃取誘導的細胞凋亡反應（補充表S2和圖2A）。寬葉獨行菜的氯仿萃取對人類PC-3 前列腺癌細胞凋亡的誘導作用，通過DNA的核小體間降解，導致典型的DNA階梯（圖2B）和胱天蛋白酶-3 底物的分解，進一步評估PARP（圖2C），兩種眾所周知的細胞凋亡標誌物。胱天蛋白酶-8在用1氯仿萃取處理的PC-3 細胞 中也被激活（圖2C）。這些數據表明，寬葉獨行菜氯仿萃取在大量癌細胞中，顯示出促細胞凋亡活性，這可被bcl-xL或bcl-2異位表達抑制。
TABLE 1 由比較算法識別為與 CETP 敏感性模式相關的化合物
與估計分別含有 37.5、37.5或150 µM CETP濃度的寬葉獨行菜汁一起孵育，而達到類似數字需要≥200 µM合成 CETP。此外，將Jurkat細胞與150 µM合成CETP孵育24小時後，細胞凋亡率達到 58.99 ± 0.1% (n= 3)，而將相同濃度的 CETP (150 µM) 作為寬葉獨行菜汁添加到Jurkat 細胞中24小時後，細胞凋亡率達到 89.63 ± 0.6%（n=3) 細胞凋亡，這種差異具有統計學意義(P= 0.00041)。
此外，將寬葉獨行菜汁在 50°C下加熱5分鐘，會導致其對Jurkat細胞的細胞毒活性喪失（圖9），進一步支持了寬葉獨行菜的抗腫瘤活性在於植物的揮發性成分。為了確定寬葉獨行菜汁的體內抗腫瘤活性，我們使用了異種移植動物模型，其中將HT-29結腸癌細胞皮下，注射到每隻免疫缺陷CB17-SCID小鼠的右脅腹。在毒性分析之後，監測動物的體重減輕或任何明顯的副作用，包括強度和一般狀況的變化，我們發現每日口服劑量為200µL寬葉獨行菜汁（12mg CETP/kg 體重）的耐受性良好，選擇該劑量來測試體內抗腫瘤活性。在出現可觸及的腫瘤後，小鼠被隨機分配到寬葉獨行菜汁處理組（每天口服200 µL含有約300 ug CETP的寬葉獨行菜汁，持續25天）和對照組（水載體），每組七隻小鼠。每5天以卡尺測量，計算腫瘤體積，口服寬葉獨行菜汁可顯著抑制腫瘤生長（圖 10A）。
在治療結束時，比較未經治療的對照組和寬葉獨行菜汁治療的患有結腸癌的小鼠腫瘤，發現寬葉獨行菜具有顯著且具有統計學意義的 (P<0.05) 抗癌活性，減少了約60%腫瘤體積和重量（圖10B- D）。屍檢時的器官檢查，未發現任何明顯的毒性。與來自未處理的對照小鼠的巨大、高度血管化的腫瘤相比，來自寬葉獨行菜處理的小鼠的小腫瘤蒼白，且血管化不良（圖10B）。在寬葉獨行菜汁處理和未處理的對照組動物之間，沒有觀察到平均體重的顯著差異 。寬葉獨行菜汁處理組與未處理對照組相比，體重減輕3-5%。這些結果證明了，寬葉獨行菜汁對攜帶結腸癌異種移植物的SCID小鼠的治療效果。
在人急性T淋巴细胞（Jurkat）癌細胞中，CETP 參與半胱天冬酶（caspase）介導的細胞凋亡誘導中的外在信號傳導。（A）Jurkat細胞未經處理（Control或用不同濃度的CETP孵育24小時，然後按照第2節中描述的流式細胞儀，分析細胞凋亡，sub-G0/G1 區域的細胞百分比，代表顯示凋亡細胞。（B）Jurkat 細胞與200 µM CETP一起孵育指定時間，然後進行SDS-PAGE並用抗PARP和抗半胱天冬酶-3單克隆抗體進行如第2節中所述的免疫印跡。全長PARP (116 kDa) 和裂解產物p85以及19-和 17-kDa裂解的活性半胱天冬酶-3形式的遷移位置已標明。β-肌動蛋白，用作等量蛋白質的內部對照，在每個泳道中加載。未處理的對照細胞（C）平行運行。（C）Jurkat細胞在沒有或有20 µM半胱 天冬酶原抑製劑（Pan-caspase inhibitor）z- VAD-fmk的情況下預孵育1小時，然後在200 µM存在的情況下孵育CETP處理24小時，並通過流式細胞儀分析，以評估細胞凋亡。未處理的對照細胞（對照）平行運行。（D）用對照pcDNA3空載體(JK)，或用 FADD-DN (JKFADD-DN) 穩定轉染的Jurkat細胞未經處理或用200µM CETP處理24小時，然後是亞細胞中的細胞百分比G0/G1區域代表凋亡細胞，通過流式細胞儀進行定量。未處理的細胞（對照）平行運行。（E）Jurkat細胞與200µM CETP一起 孵育指定時間，然後進行SDS-PAGE並用抗半胱天冬酶-8單克隆抗體進行免疫印跡。顯示了裂解的活性半胱天冬酶-8形式 (18-20 kDa)的遷移。未處理的對照細胞（C）平行運行。β-肌動蛋白用作每個泳道中等量蛋白質加載的內部對照。（F）Jurkat細胞在沒有或有 20 µM半胱天冬酶-8 抑製劑 z-ETD-fmk的情況下預孵育1小時，然後在200HM CETP 存在下孵育24小時，並通過流式細胞術分析以評估細胞凋亡。未處理的對照細胞（對照）平行運行。僅用z-VAD-fmk 或 z- IETDfmk 孵育細胞不會誘導細胞凋亡 (<4%)。顯示的數據，是平均值±SE，或三個獨立實驗的代表。星號表示，CETP 處理的細胞與用半胱天冬酶抑製劑預處理，然後用CETP處理的細胞之間，以及用CETP處理的Jurkat和 Jurkat/FADD-DN細胞之間的統計學顯著差異 (*P < 0.05)。
我們的數據表明寬葉獨行菜萃取和果汁顯示體外和體內抗腫瘤活性，並且CETP是十字花科植物中最活躍的成分，是其抗癌活性的基礎。CETP顯示出針對大量人類癌細胞系的廣譜細胞毒活性，並且 CETP在NCI-60細胞系藥物篩選組中的抗增殖活性特徵不同於已知的抗癌劑，如通過比較分析評估的那樣。唯一顯示Pearson相關係數高於0.5的抗腫瘤化合物是從Brucea物種（苦木科）4 1 . 4 3 . 4 4 中獲得的植物來源的類苦木素三萜 bruceantin(0.537)，這表明CETP和bruceantin的敏感性模式之間存在適度的關係。它已被證明可激活細胞凋亡的半胱天冬酶和線粒體途徑。41 在這裡，我們發現 CETP 促進多種人類血液癌細胞和實體瘤衍生細胞的細胞凋亡，以及死亡受體介導的外在和線粒體內在細胞凋亡信號通路，似乎與CETP的殺傷作用有關。正如通過使用FADD顯性失活形式（防止死亡受體信號）和Bcl-2或Bcl-xL的異位表達所顯示的抑製作用所證明的那樣（保護線粒體免受損傷）。半胱天冬酶原抑製劑（Pan-caspase inhibitor）z-VAD-fmk 沒有完全抑制細胞凋亡反應的事，實可能表明額外的半胱天冬酶非依賴性細胞凋亡過程抑製劑z-VAD-fmk沒有完全抑制細胞凋亡反應可能表明額外的半胱天冬酶非依賴性細胞凋亡過程45 也可能發生。CETP的敏感性模式，顯示出對血液、前列腺、黑色素瘤、結腸和肺癌細胞系的藥效，考慮到CETP是一種揮發性化合物，後者特別令人感興趣。我們的結果還表明CETP對腫瘤細胞的殺傷活性涉及誘導細胞凋亡，而不是壞死。闡明CETP抗腫瘤活性的作用機制，可能對設計與觸發不同信號通路和細胞死亡類型的其他化合物。
線粒體介導的信號轉導參與CETP誘導的細胞凋亡。（A）人急性T淋巴细胞（Jurkat）細胞在200 um CETP存在下孵育指定時間，通過流式細胞儀評估△Ψm 破壞[DiOC6(3)low] 和ROS生成（DHE->Ethhigh）。未處理的對照細胞平行運行。（B）Jurkat細胞未經處理（對照），或在沒有或有5mM NAC、5µg/mL CSA 和 5mM GSH 的情況下，預孵育。然後在存在或不存在200µM CETP 的情況下，孵育24小時。並通過流式細胞儀進行分析，來評估細胞凋亡。(C) Bcl-xL過表達消除了HeLa 細胞中 CETP 誘導的細胞凋亡（200 µM CETP，48小時），測量為細胞週期分析的sub-G0 /G1 區域中的細胞百分比。 顯示的數據是，平均值±SE，或三個獨立實驗的代表。星號表示CETP處理的細胞，與用NAC、GSH 或 CsA 預處理，然後用CETP 處理的細胞之間，以及用CETP處理的HeLa和 HeLa- Bcl-xL 細胞之間的統計學顯著差異 (*P < 0.05)。
CETP是抱子甘藍（椰菜仔，Brussels sprouts）原汁的主要硫代葡萄糖苷分解產物，46代表蕓苔屬蔬菜。47富含蕓苔屬蔬菜的飲食，可降低患某些癌症的風險。8-11 口服純芥子油苷48 或生抱子甘藍 （Brassica oleracea var. gemmifera）49 是烯丙基芥子油苷（sinigrin）特別豐富的來源，在暴露於化學致癌物1,2-二甲基肼（1,2-dimethylhydrazine）後，導致大鼠結直腸隱窩的細胞凋亡增加。
異硫氰酸酯（isothiocyanates）以硫代葡萄糖苷（Glucosinolates）的形式存在於各種十字花科蔬菜中，例如西蘭花、捲心菜、西洋菜等，50並且也存在於寬葉獨行菜中。異硫氰酸烯丙酯（Allyl isothiocyanate）是十字花科蔬菜的一種成分，具有細胞生長抑制和細胞毒活性，導致 G2/M 細胞週期停滯，誘導細胞凋亡，並顯示出體內抗腫瘤活性。51,52
寬葉獨行菜汁的色譜圖（chromatographic profile）。色譜圖顯示烯丙基氰（allyl cyanide）(3.328)、異硫氰酸烯丙酯（Allyl isothiocyanate）(7.56)和1-氰基-2,3-環硫丙烷（1- cyano-2,3-epithiopropane 或 CETP）(11.282) 作為氣相色譜鑑定（gas chromatography）的主要高峰（peaks），以及每種化合物出現的時間。苯甲基異硫氰酸酯（benzyl isothiocyanate）(21.015) 用作內標。
CETP和寬葉獨行菜汁中存在的其他化合物，誘導細胞凋亡。HeLa 細胞未經處理（對照）或與200 µMCETP (CETP)、烯丙基氰（allyl cyanide 或 AC) 或異硫氰酸烯丙酯（Allyl isothiocyanate 或 AITC) 或指定組合（每種化合物 200 µM）一起孵育 48小時，然後以流式細胞術分析細胞凋亡。每個直方圖中，顯示了代表凋亡細胞的sub-G0/G1區域中的細胞百分比。這顯示了三個獨立實驗的具代表性細胞週期概況蔬菜和膳食異硫氰酸酯（isothiocyanates）顯示出抗增殖活性，破壞微管細胞骨架，導致細胞生長停滯，並誘導人類癌細胞凋亡。53-59然而，與之前的假設相反，已發現異硫氰酸烯丙酯（Allyl isothiocyanate）既不是新鮮捲心菜中存在的主要化合物，也不是負責抑制這些十字花科植物細胞增殖的主要化合物。46 事實上，從抱子甘藍和新鮮捲心菜中分離出的主要成分，以及新鮮破壞的捲心菜中烯丙基芥子油苷（sinigrin）的主要水解產物，被確定為揮發性化合物CETP。46,60
使用膜聯蛋白（Annexin）V/碘化丙錠 (propidium iodide，PI) 測定法在HeLa細胞中，通過CETP誘導細胞死亡。未經處理的對照細胞（對照）和用200 µM CETP處理48小時的細胞，使用膜聯蛋白V-FITC / 碘化丙錠測定，通過流式細胞術（flow cytometry），分析細胞死亡的誘導。膜聯蛋白V+/碘化丙錠-細胞（右下象限）代表凋亡細胞，膜聯蛋白V+/ 碘化丙錠+細胞（右上象限）代表晚期凋亡或壞死細胞。指出了每個像限中的細胞百分比。顯示的結果，代表進行的三個實驗。
通過加熱使寬葉獨行菜汁中的促細胞凋亡活性喪失。寬葉獨行菜汁未經處理（寬葉獨行菜汁）或在 50°C下加熱 5分鐘（加熱寬葉獨行菜汁），然後在孵育48小時後，通過流式細胞術（flow cytometry），測定促進人急性T淋巴细胞（Jurkat）細胞（2 x 10 個細胞/孔，6 孔培養皿）凋亡的能力。顯示的數據，是三個獨立實驗的平均值±SE。星號表示，未加熱和加熱寬葉獨行菜汁之間的統計顯著差異 (*P < 0.05)
然而，與異硫氰酸酯（isothiocyanates）相比，蕓苔屬蔬菜中硫代葡萄糖苷（Glucosinolates）降解產生的腈類（nitriles）受到的關注相對較少。此報告的結果首次表明，源自烯丙基芥子油苷（sinigrin）的環硫腈（epithionitrile），對自不同組織的大量人類腫瘤細胞，具有體內和體外抗腫瘤活性和促凋亡作用。
我們的結果與最近的發現一致，並擴展了最近的發現，表明CETP在體外誘導人肝癌細胞的細胞死亡，並且甘藍植物基質的存在增強了肝細胞癌細胞中CETP介導的毒性。47有趣的是，我們還發現寬葉獨行菜汁對人類癌細胞系顯示出高凋亡活性，而它所含的CETP濃度低於合成 CETP 達到類似結果所需的濃度。基於這些理由，可以設想，當CETP存在於寬葉獨行菜汁中，而不是分離時，它的穩定性或活性可能會增加。在這方面，植物成分之間的協同作用已被描述為草藥和萃取。61,62我們在這裡發現異硫氰酸烯丙酯的添加，增強了CETP促細胞凋亡活性。不能排除CETP與十字花科植物的其他成分協同過程的假定存在。
寬葉獨行菜果汁在小鼠HT-29異種移植模型中的抗腫瘤作用。(A) CB17-SCID小鼠被s.c.接種了5 x 10^6 HT-29人類癌細胞。具有5 x 10^6 HT-29人類癌細胞。在可觸及的腫瘤發展後，開始每日口服寬葉獨行菜汁（200 µL 寬葉獨行菜汁；12 mg CETP/ kg）。在指定時間對每個腫瘤的最長和最短直徑進行卡尺測量。與載體處理的對照組相比，寬葉獨行菜汁顯著抑制 HT-29 腫瘤生長（P < 0.05；從處 理第20天到實驗結束）。 (B) 在用寬葉獨行菜汁處理25天後，觀察到顯著的HT-29腫瘤生長抑制。 顯示了從載體處理的對照 HT-29小鼠（對照）和寬葉獨行菜處理的 HT-29小鼠中分離的代表性腫瘤。(C, D) 完成體內試驗（25 天）後，處死經載體處理的對照和經寬葉獨行菜處理的小鼠，並測量腫瘤體積 (C) 和重量 (D)。A、C 和 D 中顯示的數據是平均值 ±SE (n = 7)。星號表示在P < 0.05 (*) 時，有顯著差異的值。
結果表明，寬葉獨行菜汁通過CETP介導的作用機制，顯示出顯著的體內抗腫瘤活性。以前已知的抗癌劑，並且這種活性可能涉及CETP與其他植物成分的協同作用。總結來說，我們的數據表明寬葉獨行菜在癌症治療中具有推定的有益作用，並且需要對該植物進行進一步研究以尋找其他活性成分，可以穩定和或增強CETP抗癌作用的抗腫瘤成分。
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This work was supported by grants from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (SAF2011-30518; SAF2014-59716-R: CTQ2014-55888-C03-01~R), Instituto de Salud Carlos111 (RD12/0036/ 0065 from Red Tematica de Investigacion Cooperativa en Cancer,
cofunded by the EU'S European Regional Development Fund-FEDER),
and the European Community's Seventh Framework Programme
FP7-2007-2013 (HEALTH-F2-2011-256986, PANACREAS).
ORCID
Faustino Mollinedo C http://orcid.org/OOOO-0002-4939-2434
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Conde-Rioll M, Gajate C, Fernandez
JJ, et al. Antitumor activity of Lepidium latifolium and identification of the epithionitrile l-cyano-2,3-epithiopropane as its major active component. Molecular Carcinogenesis. 2018;57:347-360.
https://doi.or /10.10021mc.22759
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